13. 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5 - 10 %DMSO (dimethyl
sulfoxide) 和 90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于 DMSO
稀釋時會放出大量熱能， 故不可將 DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完
成。
14. DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用之 DMSO 等級， 必須為 Tissue culture grade 之 DMSO (如 Sigma
D2650)， 其本身即為無菌狀況， 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存
于 4°C， 避免反復冷凍解凍造成 DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機
會。若要過濾 DMSO， 則須使用耐 DMSO 之 Nylon 材質濾膜。
15. 冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于 4℃ 30~60 分鐘→ (-20 ℃30 分鐘*) → -80
℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽 vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降 1-3 ℃ 至
–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。*-20 ℃不可超過 1 小時， 以
防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活
率稍微降低一些。
16. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度？
冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml
vial 為宜。
17. 應如何避免細胞污染？
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為
無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作
技術、清潔的環(huán)境、與品質良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。
18. 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理？
加入相應抗生素。直接滅菌后丟棄之。 % h7 K+ d* K' K, J
19. 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分
辨之。
20. 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實
驗前，必須確認細胞為 mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。
21. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
22. 為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且 pH 值會越來越偏堿性？
培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之 CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏
堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為 phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗
紅。培養(yǎng)基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入
無菌過濾之 CO2， 以調(diào)整 pH 值。
23. 各種細胞培養(yǎng)用的 dish，flask 是否均相同？
不同廠牌的 dish 或 flask， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同，
雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之 dish 或 flask
而有顯著之生長差異。 ) Z, r* D" X+ X' W/ p' ~
24. 購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？
研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的
失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應
待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
